ПЦР состоит из трех основных процедур: 

 Выделение ДНК/РНК

Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. В случаях, когда не требуется достижения высокой чувствительности анализа, например, при идентификации МБТ после первичного культивирования, достаточна их обработка, позволяющая лишь разрушить микробную стенку: нагревание в лизирующем буфере, ультразвуковая обработка или использование ферментов (лизоцим) без последующего выделения ДНК.

При отсутствии в пробе ингибиторов Taq-полимеразы (гемоглобина или других) и наличия десятка копий ДНК-матрицы в объеме, вносимом в пробирку со смесью всех реагентов ПЦР, подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менингитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦР без всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В большинстве случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов, биоптатов, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного результата следует выделить ДНК тем или иным способом. Благодаря этому происходит концентрирование исследуемой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-полимеразы.

В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее - природой его клеточной стенки.

Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, применяют классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и, в первую очередь, от ингибиторов Taq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании сорбентов. Подготовка материала с его использованием занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может быть применена, так как не гарантирует удаление возможных ингибиторов.

Для проведения ПЦР в реакционный буфер вводят определенное количество коротких (15-30 пар оснований) олигонуклеотидов (праймеров), комплементарных последовательностям, фланкирующим участок ДНК, копию которого хотят получить. Праймеры подбирают таким образом, чтобы их 3' -концы были ориентированы навстречу друг другу, т.е. синтезировался фрагмент ДНК, заключенный между праймерами. ПЦР проводят следующим образом: сначала реакционную смесь нагревают до температуры 90-94° С, вызывая этим денатурацию ДНК, затем температуру снижают до 50-65° С в зависимости от нуклеотидной последовательности праймеров, чтобы отжиг происходил в строго комплементарных участках, и, наконец, в смеси устанавливают температуру, оптимальную для работы ДНК-полимеразы. При воспроизведении этого цикла количество копий участка ДНК, находящегося между местами отжига праймеров, возрастает в логарифмической зависимости, т.е. от одной двухцепочечной молекулы можно получить 2ⁿ одноцепочечных копий, где "n" равно количеству циклов.

Применение термостабильных полимераз требовало выяснения зависимости их синтетической активности от условий реакции. Исследование связи активности фермента с температурой показало, что некоторую активность (несколько десятков пар оснований, включенных в синтезируемую цепь в течение одной минуты) можно наблюдать при комнатной температуре. Заметное увеличение активности наблюдалось при температурах 50-65° С, а от 65° до 75-79° С была установлена логарифмическая зависимость синтетической активности от температуры. Надо отметить, что на активность фермента оказывают влияние большое число факторов, и поэтому приведение точных данных о максимальной активности Taq-полимеразы затруднено.

Специфичность ПЦР и количество амплифицируемой ДНК, которое определяет чувствительность, могут значительно варьировать в зависимости от концентрации и качества 5 основных компонентов реакционной смеси (ДНК-матрицы, Taq-полимеразы, праймеров, dNTP и ионов Mg) и температурного режима ПЦР.

Даже при оптимальных концентрациях фермента, ионов Mg, праймеров и dNTP специфичность и чувствительность ПЦР очень сильно зависит от температуры отжига праймеров (2-я стадия цикла ПЦР): неспецифичность ПЦР-амплификации повышается при снижении температуры отжига ниже оптимальной и при повышении концентраций праймеров и dNTP выше оптимальных, а при повышении температуры отжига выше оптимальной снижается выход специфической амплифицируемой ДНК вплоть до ее полного исчезновения .

Детекция продукта ПЦР

Присутствие специфического ПЦР-продукта (ампликона) детектируют электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием агарозном или полиакриламидном гелях или альтернативными технологиями. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм. Полосы визуализируют с помощью ультрафиолетового подсвечивания в трансиллюминаторе и последующим фотографированием. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и ДНК-стандарту. Положительный результат оценивают по расстоянию пробега визуализированной полосы, соответствующему полосе положительного контроля, что свидетельствует о синтезе фрагмента ДНК, равного по размерам положительному контролю. Для такого выявления необходимо не менее 20 нг ДНК.

Дополнительные доказательства специфичности ампликона можно получить путем расщепления специфическими рестриктазными ферментами или путем гибридизации со специфическим радиоактивным или флуоресцентным олигонуклеотидным зондом. При жидкостно-фазной гибридизации зонд добавляется к амплификату, а затем производится электрофорез в геле. При твердофазной гибридизации амплификат фиксируется на мембране, а затем гибридизируется с зондом. Такое подтверждение специфичности в практической диагностике производится редко, по необходимости.

При определении амплифицированной ДНК методом Саузерн-блота и дот-гибридизации отмечено повышение чувствительности анализа, но для получения ответа требуется дополнительно 1-2 дня.

Прямое секвенирование амплифицированной ДНК является также высоконадежным методом доказательства специфичности, но применяется в основном для идентификации точечных мутаций генов.

ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты). Следует иметь не менее двух комнат:

 пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа - приготовление реакционной смеси и постановка ПЦР рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении); в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты);

 пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации. В пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекционных возбудителей, диагностика которых проводится в данной лаборатории. Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как можно дальше от пре-ПЦР-помещения. Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в пре-ПЦР-помещение.

Важным моментом организации работы является использование для каждой стадии процесса отдельного оборудования, реагентов, соблюдение чистоты на рабочем месте, обработка поверхностей 0,5% раствором гипохлорита натрия и ультрафиолетовое облучение.