Преимущества ПЦР

1. Прямое определение наличия возбудителей.

Метод полимеразной цепной реакции рассчитан на выявление нуклеиновых кислот возбудителя. Этим он выгодно отличается от многих традиционных методов диагностики, которые обеспечивают обнаружение косвенных признаков инфекции (антител либо белков-маркеров, являющихся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов), дающее лишь опосредованное свидетельство наличия заболевания.

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. ПЦР аналогична росту бактерий на искусственных питательных средах (процессу биологической амплификации), при которой одна микробная клетка, образуя видимую колонию, амплифицируется в 10⁵-10⁶ раз, давая возможность определить свойства бактерии, манипулируя уже с целой колонией. Как и питательные среды, которые могут быть селективными, поддерживающими рост только одного микроорганизма, или обогатительными, дающими возможность размножаться широкому кругу микроорганизмов, так и праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые рода или семейства микроорганизмов.

Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаружить единичные бактериальные клетки или вирусные частицы. Но это преимущество ПЦР уместно рассматривать при сравнении с другими молекулярно-генетическими или иммунологическими методами диагностики. Использование ПЦР позволяет определять инфекционный агент непосредственно в биологическом материале с исключительно высокой чувствительностью - порядка 1-10 микроорганизмов или вирусных частиц при высокой специфичности, обеспечиваемой последовательностью нуклеотидов синтезируемого фрагмента ДНК. Исходный материал для ПЦР может быть получен из плевральной жидкости, мокроты, спинномозговой жидкости, периферической крови, а также из биопсийного материала и парафинированных тканей, т.е. из любой ткани или жидкости, которые могут быть обеззаражены фенолом или нагреванием, а также храниться неограниченно долго, что не влияет на результаты исследования .

Однако высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроорганизма или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалам влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул.

4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК/РНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы.

5. Высокая скорость получения результата анализа

Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, занимающее большое количество времени. Унифицированный метод обработки материала и детекции продуктов реакции, автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 часа. Этим он выгодно отличается от других лабораторных методов, которые дают замедленные результаты.

6. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций

Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении трудно культивируемых, некультивируемых, требующих сложной питательной среды и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Диагностические возможности ПЦР не ограничены способностью микроорганизма расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (поскольку их чувствительность сопоставима), а в способности идентифицировать, определять свойства и работать с большим разнообразием микроорганизмов, которые не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).

Дополнительные возможности повышения специфичности и чувствительности ПЦР-амплификации дает так называемая "nested-PCR" . Если первичная ПЦР недостаточно чувствительна или среди продуктов реакции наблюдается накопление неспецифических фрагментов, происхождение которых трудно объяснить, проводят еще одну серию амплификаций с использованием другого набора олигонуклеотидных праймеров. То есть сначала для амплификации используют внешние праймеры, а затем - внутренние (nested) праймеры. В качестве матрицы используется первичный продукт ПЦР, а внутренние олигонуклеотидные праймеры имеют гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифицированного фрагмента (рис.5). Такая процедура позволяет получить большое количество искомых фрагментов ДНК, немного короче, чем исходный фрагмент.

Для повышения чувствительности и специфичности реакции в последние годы широко используется такой простой прием как "горячий старт" . Он обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоев (верхнего и нижнего), разделенных прослойкой из парафина. Нижний слой содержит праймеры, верхний - фермент Taq-полимеразу и ДНК-мишень. Смешение слоев и превращение их в реакционную смесь происходит только при расплавлении парафина на стадии денатурации, что исключает неспецифический отжиг праймеров. Дальнейшее технологическое совершенствование диагностических тест-систем на основе ПЦР в настоящее время ведется по трем основным направлениям:

1. Создание методических приемов, предохраняющих от возможности получения ложноположительных результатов.

2. Использование внутреннего контроля, наличие которого гарантирует отсутствие ложноотрицательных результатов. Матрицей для внутреннего контроля является фрагмент ДНК, содержащий места отжига используемых праймеров, но находящихся друг от друга на расстоянии, меньшем по сравнению с тестируемым фрагментом. Образующийся на такой матрице ампликон будет меньше по размеру, чем искомый. Отсутствие синтеза контрольного ампликона указывает на наличие в исследуемом образце ингибитора ПЦР.

3. Превращение этой реакции в количественный тест. Это достигается благодаря титрованию продукта амплификации с использованием внутреннего стандарта, что позволяет перевести значение титров в абсолютное количество бактериальных клеток или вирусных частиц.