О методе ПЦР-диагностики
 | |
| |
|
Основы метода полимеразной цепной реакции
Амплификация - это изолированное умножение гена или его фрагмента, являющееся одним их способов выживания микроорганизмов и клеток животных, например, в условиях действий антибактериальных или противоопухолевых препаратов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это амплификация специфических последовательностей нуклеиновых кислот, с помощью которой в течение нескольких часов можно размножить нужную последовательность в миллионы раз.
ПЦР позволяет осуществить такую амплификацию в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы из 4 дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, являющихся структурными элементами любой ДНК, и коротких олигонуклеотидных 20-30-членных затравок (праймеров), комплементарных 3´-концевым последовательностям антипараллельных цепей ДНК гена.
Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, позволяющее из незначительного количества анализируемого материала получить достаточное количество ДНК копий для идентификации их методом электрофореза.
Использование ПЦР позволяет определять инфекционный агент непосредственно в биологическом материале с исключительно высокой чувствительностью - порядка 1-10 микроорганизмов или вирусных частиц - при высокой специфичности, обеспечиваемой последовательностью нуклеотидов синтезируемого фрагмента ДНК.
В основе метода лежит многократное повторение циклов репликации ДНК. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами (рис.1). На первой стадии при 93-95° С происходит разделение комплементарных цепей двухцепочечной молекулы ДНК (денатурация).
|
Рисунок 1. Первая стадия (денатурация молекулы ДНК) |
|
|
|
Денатурация при 93-95° С |
|
|
|
Рисунок 2. Вторая стадия (отжиг праймеров ) |
|
|
|
Снижение температуры до 50-65° С приводит к присоединению праймеров к гомологичным участкам ДНК-мишени (отжиг). |
|
Рисунок 3. Третья стадия (достраивание цепи ДНК) |
|
|
|
|
|
|
Праймеры - искусственно синтезируемые одноцепочечные дезоксиолигонуклеотиды, состоящие из 20-30 оснований. Они представляют собой концевые последовательности интересующего фрагмента ДНК. При температуре 72° С протекает синтез полинуклеотидных цепей путем удлинения праймеров с помощью дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. [ 30] . Длина ампликонов, начиная с третьего цикла, становится стандартной, т.е. соответствует числу пар нуклеотидов фрагмента ДНК-матрицы между 3´ -концами смыслового и антисмыслового праймеров. Они накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицированного участка. Процесс является цепным, т.к. синтезированные фрагменты ДНК в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез (рис.4).
|
Рисунок 4. |
|
|
Денатурация |
|
|
Отжиг праймеров |
|
|
Достраивание цепи ДНК |
|
|
Повторяя 3 стадии амплификации 30-40 раз, за 1,5-3 часа получают миллионы копий специфического участка ДНК или РНК вируса, бактерии, клеток крови, т.е. нарабатывается нуклеиновая кислота в количестве, достаточном для ее визуализации с помощью электрофореза.
Обычно в результате реакции получают несколько мкг продукта. Это можно объяснить неполным разрушением комплексов молекул ДНК с другими молекулами во время экстракции, нарушениями структуры ДНК, затрагивающими матричный участок, образованием петель и реассоциацией двуспиральной структуры при охлаждении после денатурации. Понижение эффективности первых циклов значительно сказывается на количестве продукта реакции. С другой стороны, при увеличении количества циклов была отмечена потеря известного количества продукта, вероятно, за счет деградации. Кинетика ПЦР имеет экспоненциальный характер только на начальном этапе (20-25 циклов), затем начинается выход на плато (после 40-45 циклов) в силу истощения dNTP, праймеров и нарастающего температурного повреждения Taq-полимеразы, конкуренции за фермент ампликонов, когда их число начнет превышать число молекул Taq-полимеразы. При содержании в пробе около 10 молекул ДНК-матриц, как правило, достаточно 35 циклов.
Таким образом, оптимальное соотношение ДНК-полимеразы и матричной ДНК получается, вероятнее всего, в конце первых десяти циклов. Некоторым исследователям удалось получить продукты амплификации практически из одной копии матричной последовательности гена b-глобина человека .
